CRISPR/Cas9（成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)極大地促進(jìn)了多種物種的體外和體內(nèi)基因抑制實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特異性。gRNA與靶位點(diǎn)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點(diǎn)。Cas9掃描基因組并切割與gRNA互補(bǔ)的序列，前提是這些序列跟隨著一段NGG前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）。雙鏈DNA斷裂隨后被HDR或者NHEJ途徑修復(fù)，從而產(chǎn)生不同大小長(zhǎng)度的位點(diǎn)突變（堿基插入或缺失）。

使用一個(gè)一體化的同時(shí)表達(dá)Cas9和gRNA的載體，或者分開(kāi)表達(dá)Cas9和gRNA的載體，可以方便地在線蟲(chóng)中進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯。該載體系統(tǒng)屬于后者，包含一個(gè)線蟲(chóng)密碼子優(yōu)化的U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的gRNA。該載體可以被注射到線蟲(chóng)的遠(yuǎn)端性腺，然后進(jìn)入生殖細(xì)胞細(xì)胞核。使用該載體注射的線蟲(chóng)可以表達(dá)Cas9。篩選突變后代，獲得突變可遺傳的基因敲除線蟲(chóng)品系。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更新信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

通過(guò)在載體骨架上整合進(jìn)人工合成的啟動(dòng)子近側(cè)內(nèi)含子序列，我們的載體經(jīng)過(guò)優(yōu)化可以在線蟲(chóng)中高效表達(dá)轉(zhuǎn)基因。

技術(shù)簡(jiǎn)單：使用顯微注射即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。.

靈活性：根據(jù)使用者的實(shí)驗(yàn)需求，我們的線蟲(chóng)gRNA表達(dá)載體可以搭配不同類型的Cas9使用。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)必須包含NGG序列（使用較多），也叫做PAM序列，位于gRNA識(shí)別序列3'末端。 

CeU6: C. elegans U6 small nuclear RNA promoter. It drives strong expression levels of small RNAs.

gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.

Terminator: Pol lll transcription terminator. It allows transcription termination of small RNA transcribed by Pol lll RNA polymerase.

Ampicillin:  Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori:   pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.